在体外的平行研究中，自然刺激诱导的NETs生成完全独立于细胞裂解和死亡。尽管NETs的组成在不考虑刺激因素的情况下是相似的，但目前只在PMA诱导的NETs上做过蛋白质组学。其中一组显示，非裂解方式释放出的NETs包含的是线粒体DNA而不是细胞核DNA，从定义上讲，这些NETs缺乏组蛋白，组蛋白是一种主要的抗菌和宿主细胞毒素。第二组主要由含或不含血小板的细菌及细菌产物组成，显示了非裂解释放的NETs是由细胞核DNA而不是线粒体DNA构成的，从而降低了蛋白质水解活性。我们单方面认为，PMA可能激活中性粒细胞的许多通路，并共同导致NETs生成、ROS的产生以及坏死细胞的死亡，这可能让NETs释放的研究更为复杂。实际上，用PMA刺激可以在30分钟内检测到NETs，而细胞死亡一般发生在3小时内，这期间能看到所有细胞内容物的无规律释放，这可能使NETs更具毒性。另外，PMA诱导的NETs释放和PMA诱导的细胞裂解二者之间并没有因果关系。最后，为了严谨起见，我们未使用裂解和非裂解NETosis （这个术语自相矛盾），而是使用了裂解与非裂解型的NETs生成作为表述。
1. 裂解型的NETs生成
首先要描述一下细胞死亡或裂解型NETs释放前的NETs生成（图1A）。PMA刺激中性粒细胞，通过PKC和Raf-MEK-ERK信号通路激活NADPH氧化酶，并产生ROS。激活的蛋白精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）会使组蛋白高瓜氨酸化，引起染色质解旋，同时使MPO和NE从细胞质嗜天青颗粒中释放。总之，NETome中发现了24种不同的蛋白质。据报道，体内和体外实验中均观察到MPO与染色质结合，并激活小型嗜天青颗粒内的NE。NE分解细胞质中的肌动蛋白，转移到细胞核并裂解组蛋白。随后，核膜被细胞周期蛋白分解，在胞质中释放染色质，与胞质蛋白混合。gasdermin D （GSDMD）是最新发现的介导巨噬细胞焦亡的因子，也参与了细胞裂解和NETs释放的机制。在PMA诱导NETs释放的过程中，NE将GSDMD裂解为活性形式（GSDMD- NT），在质膜和颗粒膜上生成孔洞，促进NE和其他颗粒内容物的释放。
研究表明，NETs的生成机制可能取决于激活中性粒细胞的刺激类型。在两种慢性肉芽肿疾病患者和分别用球曲霉或PMA刺激的基因敲除小鼠中，NADPH氧化酶的缺失抑制了NETs的生成。然而，在用金黄色葡萄球菌刺激中性粒细胞时，NETs的生成与氧化剂的产生无关。这也适用于白色念珠菌、离子霉素和烟碱诱导的NETs释放，这一过程独立于NADPH氧化酶的生成。然而，烟碱和离子霉素刺激产生NETs的机制依赖于AKT信号和钙离子介导的线粒体ROS释放（即需要氧化剂，但获得的机制不同）。大量的研究也表明，MPO和PAD4的药理或遗传障碍会减少或阻碍NETs的释放。相反，铜绿假单胞菌的NETs生成似乎与MPO活性无关，而白色念珠菌、肺炎克雷伯菌和胆固醇晶体诱导的NETs释放独立于PAD4。最新的数据表明，组蛋白瓜氨酸化并不会促进染色质的解旋。NE的抑制阻断了染色质的解旋而不干扰组蛋白瓜氨酸化。PMA诱导NETs生成需要PKC，而幽门螺杆菌诱导的NETs生成则不需要PKC。总之，中性粒细胞NETs的生成机制取决于原始刺激。然而，如此巨大的差异引发了一个问题，即是否相关研究的研究对象并非同一过程？
2. 非裂解型的NETs释放
据报道，裂解型的NETs生成所需的时间为3到4小时。相比之下，中性粒细胞也可以非常迅速地（5-60分钟内）释放NETs，并且细胞不需要死亡（图1B）。实际上，在体内或体外实验中，中性粒细胞在与脂多糖（LPS）激活的血小板结合后，几分钟内就会生成NETs，但无法被绿菁SYTOX（死细胞核酸染料）染色，绿菁SYTOX是一种活细胞不渗透型核酸染料。在人体脓毒症期间，中性粒细胞与TLR4激活的血小板结合，然后通过非裂解型的方式释放NETs。当在体内注射大肠杆菌时，血小板立即与中性粒细胞结合然后诱导NETs生成，然而却未观察到中性粒细胞裂解，该结果与上述机制类似。其他细菌也能诱导非裂解型的NETs释放。从机制上看，在应答金黄色葡萄球菌诱导的非裂解型NETs生成过程中并不需要NADPH氧化酶，释放后中性粒细胞仍然能够迁移和吞噬。此外，非裂解型NETs的生成需要激活特定的受体，包括TLRs的激活，以及在感染金黄色葡萄球菌和白色念珠菌时补体受体的激活。此外，人的中性粒细胞在用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子激活，并用LPS或补体因子5a短暂刺激后也会释放NETs，但这一过程需要参与的是线粒体，而不是细胞核DNA。有趣的是，视神经萎缩1（一种对线粒体生物生存很重要的线粒体内膜蛋白）对于NETosis也很重要，它通过刺激微管网络的生成，并随后释放DNA。在最近的一项研究中，我们认为这对NETs的产生提供了重要的解释，Branzk及其团队证明了中性粒细胞能够感知微生物的大小，在应对大型病原体时有选择地释放NETs，如白色念珠菌菌丝，但对小型酵母或单个细菌没有反应。本研究报道的机制是吞噬作用通过阻止NE向细胞核移动来阻止NETs的释放。这可能会延伸到与像金黄色葡萄球菌这样在体内以团块形式存在的细菌以及生物膜，这两者都能诱导NETs的释放而不是吞噬。值得一提的是，NETs的释放可以通过吞噬血小板而停止，这表明，无论被吞噬的是什么颗粒物，NETs的释放都会中止。这也解释了为什么有些中性粒细胞在感染时会产生NETs，以及为什么吞噬了细菌的中性粒细胞在裂解释放NETs时不会释放已吞噬的细菌。
PMA的机制为非裂解型的NETs释放研究提供了信息。例如，在非裂解型的NETs释放过程中，NE也被转移到细胞核中，PAD4被激活，诱导染色质解旋。然而，NETs的释放并没有破坏质膜，而是通过囊泡来分泌被蛋白包覆的染色质，允许中性粒细胞存活以发挥进一步的功能。由于中性粒细胞的转录活性非常低甚至不存在，失去细胞核并不影响吞噬、释放细胞毒性分子及运动等过程，尽管运动时因中性粒细胞在爬行过程中使用细胞核作为支点而发生改变。然而，就像它们的近亲红细胞和血小板一样，没有细胞核的中性粒细胞（称为细胞质）仍然发挥着重要的功能。最近，研究证明，在严重哮喘的小鼠模型中，从释放NETs的中性粒细胞中提取的细胞质能够激活肺树突细胞，将未分化的CD4+ T细胞分化为抗原特异性T辅助器17效应器（antigenspecific T-helper 17 effectors），确定了这些细胞残体的潜在致病作用。使用抗MPO和N端组蛋白尾抗体的夹心酶联免疫吸附试验来检测非裂解型NETs，证明了来自脓毒症患者循环系统中的中性粒细胞NETs来自于与NADPH氧化酶无关的非裂解途径，证实了先前来自实验性脓毒症的发现。然而，对非裂解型NETs释放的研究较少，以下问题尚待解决：（1）DNA囊泡是如何生成和释放的；（2）无核的中性粒细胞，或者称为细胞质发生了什么；（3）这一过程具体是由哪些信号通路介导的？
图1. NET的生成机制。
在鉴定中性粒细胞亚群并确定哪些中性粒细胞会释放NETs方面已经有大量的研究。实际上，并不是所有的中性粒细胞都能释放NETs；在使用金黄色葡萄球菌刺激后，只有20% - 25%的中性粒细胞释放NETs。离心后，循环系统内的中性粒细胞可通过密度梯度差从外周血单核细胞中分离出来。然而，在炎症过程中，中性粒细胞的密度改变，与外周血单核细胞密度分数相近，这被称为低密度中性粒细胞（LDNs）。LDNs是一个异质性的群体，包含了不成熟和成熟的中性粒细胞，而它们的功能取决于炎症刺激的类型。值得关注的是，已有研究表明，在自身免疫性疾病和自发性小肠肿瘤模型中，LDNs产生NETs的能力增强，更有可能是一种明显的促炎型中性粒细胞亚群。许多分子标记物已经被用来描述不同中性粒细胞亚群与NETs产生量的关系。LPS刺激的CD177-中性粒细胞不能释放NETs。嗅觉蛋白4 （OLFM4）是一种主要存在于特定颗粒中的基质糖蛋白，在10% - 30%的中性粒细胞中也存在差异表达，与可产生NETs的中性粒细胞百分比一致。NETs的生成导致OLFM4分泌，最近的一项研究表明，具有高比例OLFM4+中性粒细胞的脓毒症患者发生器官衰竭和死亡的风险更高。然而，OLFM4+中性粒细胞与释放NETs中性粒细胞之间的直接联系尚未得到证实。因此，无法确定能直接鉴别产生NETs中性粒细胞的分子标记，这就产生了一个问题，即产生NETs的中性粒细胞是否只是更老、更成熟或者分化程度更低的中性粒细胞，本质上来看其实都是同一个族群？